Hispaania vallutaja Don Nuño Beltrán de Guzmáni pidevad pealetungid riigi lääneriikide suunas, et suurendada tema domineerimist ja võimu nende alade üle, viisid uue provintsi asutamiseni, mida nimetatakse Uus-Galicia kuningriigiks.
Piirkonnas elasid erinevad põliselanike rühmad, kes laastasid pidevalt asulaid, mille hispaanlased sinna asutasid. Nuño de Guzmáni leitnant kapten Juan B. de Oñate sai käsu need provintsid rahustada ja rajada Villa de Guadalajara Nochistlán-nimelisse kohta, mis lõppes 5. jaanuaril 1532. Pidades silmas põlisrahvaste sagedasi rünnakuid linna vastu ta pidi kolima aasta hiljem Tonalá ja hiljem Tlacotláni. Kolmas ümberistumine tehti linna asustamiseks Atemajaci orgu, kus linn lõplikult asutati 14. veebruaril 1542, kusjuures Uus-Galicia kuberneriks oli Cristóbal de Oñate ja Don Antonio de Mendoza. siis Uus-Hispaania asevalitseja, kes nimetas Miguel de Ibarra linnapeaks ja leitnantkuberneriks.
Linn arenes kiiresti ja hakkas konkureerima Compostela (täna Tepic) omaga, mis oli tollal usu- ja kodanikujõudude asukoht, nii et Guadalajara elanikud avaldasid Audiencia võimudele nii suurt survet, et kuningas Felipe II otsustas välja anda 10. mail 1560 dateeritud tunnistuse, et kolida Compostelast Guadalajarasse, katedraali, kuningakoja ja riigikassa ametnikesse.
Linnastruktuur kavandati vastavalt teistele koloniaallinnadele, nii et selle kujundus töötati välja malelauana San Fernando väljakult. Hiljem rajasid Mexicaltzingo ja Analco naabruskonnad Fray Antonio de Segovia ning ühe vanima Mezquitáni naabruskonna. Ehitati ka raekoja majad praeguse San Agustini templi ja esimese kihelkonnakiriku ette, kus asub justiitspalee.
Praegu on koloniaalhoonetes viljakal suurepärasel linnal hea arv asjakohaseid arhitektuurinäiteid, nagu katedraal, must-see koht, mille ehitas aastatel 1561–1618 arhitekt Martín Casillas. Tema stiil on klassifitseeritud algavaks barokiks. Selle kindel struktuur tõuseb tänase Plaza de Guadalajara ette koos uudishimulike tornidega, mis, ehkki ei kuulu hoone algsesse stiili, on praegu tunnustatud Guadalajara pealinna sümbolina. Ürgsed tornid hävitati 19. sajandil maavärina tõttu, mistõttu lisati ka need, mis tal praegu on. Templi sisemus on poolgooti stiilis, sealhulgas pitsist valmistatud võlvid.
Muud 16. sajandist pärit religioossed piirkonnad on San Francisco klooster, mis asutati 1542. aastal jõe lähedal Analco naabruses ja reformatsiooni käigus peaaegu täielikult hävis. Selle 17. sajandi lõpus renoveeritud tempel ja tagasihoidlikest saalomoni joontest koosnev barokkfassaad on säilinud. San Agustíni klooster asutati 1573. aastal Felipe II kuningliku määrusega ja see säilitab praegu oma templi koos tõsiste herrerilike joontega fassaadiga ja siseruumidega, millel on soonilised võlvid.
Santa María de Gracia, teise kloostrifondi, hõivasid Dominikaani nunnad Pueblast, mis ehitati 1590. aastal Plaza de San Agustín ette ja mille maksis kinni Hernán Gómez de la Peña. Ehitis pidi hõivama kuus kvartalit, kuigi tänapäeval püsib ainult selle tempel, millel on 18. sajandi teisest poolest uusklassitsistlik fassaad.
